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    聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt下载

    素材编号:
    337308
    素材授权:
    免费下载
    素材格式:
    .ppt
    素材上传:
    chenshuyan
    上传时间:
    2019-02-27
    素材大小:
    494.01 KB
    素材类别:
    医疗疾病课件PPT
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    聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt

    聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt免费下载是由PPT宝藏(www.ijjv.tw)会员chenshuyan上传推荐的医疗疾病课件PPT, 更新时间为2019-02-27,素材编号337308。

    这是聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt,包括了基本原理,醋酸纤维薄膜电泳(CAME),聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),SDS-PAGE电泳琼脂糖凝胶电泳,等电聚焦电泳,双向电泳等内容,欢迎点击下载。

    电泳技术 (electrophoresis)
    本章主要内容
    基本原理
    醋酸纤维薄膜电泳(CAME)
    聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
    SDS-PAGE电泳
    琼脂糖凝胶电泳
    等电聚焦电泳
    双向电泳
    概      念
    带电粒子在直流电场中的作用下,在?#27426;?#20171;质(溶?#31890;?#20013;发生的向异性电极定向移动的现象称为“电泳”
    利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术称为“电泳技术”
    分       类
    按有无支持物分为:自由电泳,区带电泳(其中根据支持物的不同而有不同的名称如纸电泳,琼脂糖电泳等)
    按电压分:低压电泳,高压电泳
    按用途分:分析电泳,制备电泳,定量免疫电泳
    按支持物形状分:薄层电泳,平板电泳,圆盘电泳,毛细管电泳
    按区带形式分?#21495;?#29366;电泳,火箭电泳
    特      点
    凡是带电物质均可应用某一电泳技术分离,并可进行定性定量分析
    样品用量少
    设备简单
    可在常温进行
    操作简便省时
    分辨率高
    蛋白质电荷的来源
    电泳的基本原理
    带电粒子在电场中所受的力F=QE
    所受阻力F’=6πrηv
    电泳?#33014;?#26102;F=F’,则QE= 6πrηv
    迁移率(电泳淌度)=Q/ 6πrη,表示粒子在单位电场强度下的泳动速度
    不同物质能否利用电泳进行分离,决定于两者迁移率的差别,有差别才能分离。电泳后分开的距离与迁移?#30465;?#30005;压、时间等相关
    影响电泳的因素
    样品的性质
    电场强度
    缓冲液:
                 (1)pH值
                 (2) 成分
                 (3)离子强度
    支持介质:吸附、电渗,分?#30001;?br /> 温度
    电     渗 (electro-osmosis)
    在电场作用下液体相对于固体表面的移动称“电渗”
    醋酸纤维薄膜电泳 (cellulose  acetate membrane electrophoresis, CAME)
    醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯
    对蛋白质样本吸附少,分离速度快,时间短,电渗作用虽然高但很均一,不影响分离效果,经?#35813;?#21270;处理后有利于光吸收扫描测定和膜的长期保存
    影响因素:膜的性质,缓冲液,电流和电压,电泳时间和温度,电泳槽的密封性能
    聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacryamide gel electrophoresis, PAGE)
     聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide, Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide, Bis)在加速?#31890;═EMED)和催化?#31890;?#30827;酸铵)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶
    聚丙烯酰胺凝胶的聚合反应
    聚丙烯酰胺凝胶
    特点:(1)在?#27426;?#27987;度时,凝胶?#35813;鰲?#26377;弹性、机械性能好  (2)化学性能稳定,与被分离物不起化学反应   (3)对pH和温度变化较稳定  (4)几乎无电渗作用 ,只要Acr纯度高,操作条件一致,则重复性好 (5)样品不易扩散且用量少  (6)凝胶孔径可调节  (7)分辨率高
    凝胶聚合的影响因素
    空气中氧能淬灭自由基,使聚合反应终止,故聚合过程中反应液应与空气隔绝
    某些材料如有机玻璃等能抑制聚合反应
    某些化学药物如赤血盐等可减慢反应速度
    温度升高聚合加快,温度降低聚合减慢
    聚丙烯酰胺凝胶的性质
    总浓度T%:100ml凝胶中含有Acr和Bis的总克数
    T%越大,平均孔?#23545;?#23567;,凝胶机械强度增?#21360;?#20294;达15%时胶脆性增大,易断裂;T%过小则凝胶稀软不易操作
    交联度C%:交联剂Bis占单体Acr与Bis总量的百分数
    T%值固定时,C%=5%时孔径最小,高于或低于5%时孔径相应变大。C%过大胶不?#35813;鰨?#32570;乏弹性;过小则凝胶呈糊状
    分子量范围与凝胶浓度的关系
    PAGE的分类
    根据具体操作分为:圆柱型,平板型(水平方向、垂直方向)
    根据凝胶?#20302;?#30340;均匀性分为:连续?#20302;常?#19981;连续?#20302;?br /> PAGE圆盘电泳示意图
    不连续圆盘电泳示意图
    不连续电泳的物理效应
    样品浓缩效应:凝胶孔径不连续
                                缓冲液离子成分不连续
                                pH的不连续性
    分?#30001;?#25928;应
    电荷效应
       各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小和形状不同而得以分离
    PAGE常见问题
    凝胶不聚合或聚合时间过长:最常见原因是硫酸铵失效,需新鲜配制;室温较低时聚合变慢,可调整硫酸铵和TEMED用量
    指示剂向相反方向移动:电源连接错误,缓冲液选择错误
    指示剂前沿呈“曲线”:“微笑”现象由凝胶冷却不均匀造成;“皱眉”现象多由电泳装置不合?#30465;?#24213;部气泡或靠近玻片的凝胶聚合不完全引起
    SDS-PAGE
    SDS:十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate),阴离子去垢剂
    SDS带有大量负电荷,大大超过天然蛋白质原有的电荷量,从而消除或掩盖了不同种类蛋白质间的电荷差异
    SDS作为变性剂和助溶?#31890;?#33021;断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白质分子的二级和三级结构
    SDS-蛋白质的迁移率取决于分子量的大小
    SDS-蛋白质复合物的形状
    琼脂糖凝胶电泳
    琼脂糖是从琼脂中提取出来的?#37259;?#22810;糖
    优点:(1)含液体量大,达98%~99%,近似自由电泳,但样品扩散速度小,对蛋白质吸附极少  (2)分辨率高,重复性好 (3)电泳速度快 (4)?#35813;?不吸收紫外线,可直接用紫外检测仪测定 (5)区带可染色,样品易回收
    缺点:含有较多硫酸根,电渗作用大
    用途:用于核酸的分离、鉴定
    等电聚焦电泳 (isoelectric focusing electrophoresis, IEFE)
    利用具有线性pH梯度的电泳介质来分离等电点不同的蛋白质
    当蛋白?#26159;?#31227;?#30103;鋚I相同的pH处,则不再泳动,而浓缩?#19978;?#31364;的区带
    蛋白质因其等电点的不同而得以分离
    pH梯度的形成
    IEFE的聚焦效应
    常规PAGE与SDS-PAGE的区别
    IEFE优缺点
    优点:(1)分辨率高,可将pI相差0.01~0.02pH单位的蛋白质分开 (2)区带狭窄 (3)样品不管加到什么?#35838;欢?#21487;聚焦到其等电点
    缺点:(1)需用无盐溶液,而无盐溶液中蛋白质易沉淀  (2)不适于在pI点不溶解或发生变性的蛋白质
    双向电泳
    又称二维凝胶电泳
    第一相为IEFE,根据蛋白质电荷差异进行分离
    第二相为SDS-PAGE,根据蛋白质分子量差异进行分离
    分辨率极高,是蛋白?#39318;?#30740;究的关键开门技术
    转移电泳
    其它电泳技术
    脉冲场凝胶电泳
    毛细管电泳
    等等
    完!
     

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